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香菇多糖研究进展
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    糖类的研究已有百余年的历史,近20多年来,随着膜的化学功能,免疫物质的化学研究的进展以及探寻新药物资源的不断拓展和研究的深入,发现糖类在生物体中的作用不仅是作为能量资源或结构材料,更重要的是还参与了生命现象中细胞的各种活动,具有多种多样的生物学功能。多糖一般由十个分子以上的单糖通过糖苷键连接而成的高分子多聚物。多糖按来源大致可分为植物多糖、动物多糖、海藻多糖、微生物多糖即细菌多糖和真菌多糖等。其中,具有很强生物活性的真菌多糖的研究日益受到重视,真菌多糖从真菌子实体、菌丝体、发酵液中分离,是一类可以控制细胞分裂分化、调节细胞生长和衰老的活性多糖。真菌多糖作为药物研究始于20世纪50年代,在60年代以后成为免疫促进剂受到广泛关注,其中香菇多糖(1entinan,LNT)是研究得较透彻的多糖之一。

    香菇[Lentinus edodes(Berk.)Sing]为担子菌纲伞形科真菌,是世界名贵食用菌兼药用菌之一。1968年日本千原吴郎首先利用热水从香菇子实体中浸提出6种胞外多糖,1970年Chihard和Sasaki用热水浸提结合有机溶剂沉淀从香菇中提取到另外4种多糖,20世纪80年代以来,LNT的研究受到广泛的重视,取得了一系列进展。

1  香菇多糖的分子结构和理化性质

1.1结构

    有关香菇多糖的成分和结构报道甚多,但已明确结构与免疫活性关系的只有β一葡聚糖物质。该多糖的一级结构具有β-(1→3)连接的吡喃葡聚糖主链,在主链中葡萄糖的c6位上含有支点(每5个葡萄糖有2个支点),其侧链是由β-(1→6)键和β-(1→3)键相连的葡萄糖聚合体组成,在侧链上也含有少数内部β-(1→6)键(图1)。x.射线衍射分析证明,其立体结构为右旋三重螺旋的六方晶系,晶格常数a=b=1.5 nm,c=0.6 nm。采用高分辨13C-核磁共振(13CNMR)研究表明,其二级结构为凝结型的单螺旋构象。Sureniav~3j等从4种香菇中分离出的4种高分子抗肿瘤活性多糖,经检测都是(1→3)-β-D-葡聚糖,并含有4.6%~15.2%的蛋白质。但4种多糖分别被破坏了三螺旋(1→3)-β-D-构型、被超声波打成碎片、被除去结合蛋白质后,检测它们的抗肿瘤活性,发现比天然物质有所降低。这就表明,多糖的构型、相对分子质量及结合蛋白质也可能影响其抗肿瘤活性。


1.2理化性质

    香菇多糖为白色或棕黄色粉末,对光和热稳定,具吸湿性,相对分子质量较大,无甜味和还原性,部分能溶于水,在水中的溶解度随分子质量增大而降低,水溶液为中性,不溶于甲醇、已醇、丙酮等有机溶剂。

2  香菇多糖的生物活性

2.1免疫调节作用

    香菇多糖的免疫调节活性是其生物活性的重要基础。香菇多糖是典型的T细胞激活剂,体内外均能促进细胞毒T淋巴细胞(cTL)的产生,提高CTL的杀伤活力,增强正常或免疫功能低下小鼠的迟发型超敏反应(DTH),提高抗体依赖性细胞毒细胞(ADDC)活性。Oka等通过体外香菇多糖与宿主细胞共培养,流式细胞仪免疫荧光检测,研究香菇多糖免疫调节活性的触发机制,结果发现多数香菇多糖能结合到人单核细胞上,认为香菇多糖结合到人单核细胞上可能是其影响免疫系统的首要因素。

2.2抗肿瘤作用

    香菇多糖能有效预防化学性或病毒性肿瘤的发生,对小鼠S180实体瘤的抑制率高达70%~100%,其中90%小鼠的肿瘤完全消退;还能抑制化学致癌剂3一甲葱酮的致癌作用,防止小鼠肠溃疡恶化导致的结肠癌的发生。作为免疫辅助药物,香菇多糖与化疗剂联合使用有减毒增效的作用,主要被用来抑制肿瘤的发生、发展与转移,通过免疫调节作用或影响一些关键酶的活性来提高肿瘤对化疗药物的敏感性,改善患者的身体状况,延长其寿命。

    香菇多糖在治疗胃癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌等方面具有良好的疗效,能够延长肿瘤患者的存活时间,特别是胃癌和结肠直肠癌。目前香菇多糖抗肿瘤活性的机理还没有完全搞清楚,但香菇多糖的免疫调节功能是抗肿瘤活性的基础这一点得到了一致的认可。

2.3抗感染作用

    据资料报道,香菇多糖可用于治疗结核杆菌感染,能使耐药性结核病人痰菌转阴,病人外周血嗜中性粒细胞吞噬活性增加。香菇多糖还能延长李司忒氏菌感染小鼠的生存时间,这与其提高巨噬细胞功能有关,其抗感染的机制与多糖本身的特性有关。

    香菇多糖的作用机理可能是多糖分子表面与病原体表面发生粘附作用,阻截了病原体与正常细胞表面糖分子的结合,从而阻断其感染途径。硫酸化香菇多糖具有显著抗HIV作用,体外10 mg/L就能完全抑制HIV抗原的表达,其作用机理可能是干扰HIV对宿主细胞的粘附作用,抑制逆转录酶的活性。

2.4其他功能

    香菇多糖可以增强机体的排毒能力,降低由CCl4升高的血清转氨酶活性,刺激被切除部分肝的老鼠的残留肝再生,增强对洋地黄毒素的抵抗能力。香菇多糖药用功效多样,除上述外,还可以降血脂、抗衰老、抗病毒等。

3  临床应用

    动物实验和体外实验研究显示,香菇多糖虽无直接的细胞毒副作用,但可激活多种活性免疫细胞如T细胞、NK细胞,使动物肿瘤缩小及提高宿体免疫功能。国内外已开发了多种香菇多糖制剂,如能治难、天地欣等。

3.1治疗肝炎

    香菇多糖配合其他药物治疗慢性乙型肝炎,可提高乙肝病毒标志物的转阴作用,减少抗病毒药物的副作用,降酶作用快而且稳定。在临床应用中证明,香菇多糖加干扰素用于控制慢性乙型肝炎,可达到满意的疗效。

3.2治疗癌症

    在围手术期将香菇多糖溶解于5%葡萄糖液中静脉滴注,每次2 nlg,每周2次,连续用药12~16 mg为1疗程,结果有助于提高中晚期肿瘤患者术后NK,LAK细胞活性,促进LTR的恢复,也可恢复手术创伤引起的T细胞亚群分布异常,从而有利于改善患者的细胞免疫功能,促进患者手术后的恢复,延长癌症患者的生存时间并提高其生存质量。肺癌患者在化疗过程中加用香菇多糖,可明显改善肿瘤患者的免疫状态、生活质量以及生存率,尤其对小细胞肺癌患者的治疗效果更为显著。在化疗前3 d,将2 nlg香菇多糖溶解于5%葡萄糖溶液250 mL中,静脉滴注,每周2次,连续8周,则可以增强化疗的疗效,同时使患者的白细胞下降概率、胃肠毒性、肝功能损害及呕吐发生等明显降低,表明香菇多糖与化疗并用,可以增效、减毒、增强患者机体的免疫功能等。

3.3治疗各种感染

    符耀华研究表明,糖尿病并发感染的患者在口服降糖药或注射胰岛素抑制血糖的同时,应用香菇多糖可改善机体全身状况,增强机体免疫力,从而使感染得到有效控制,加快疾病的康复。

    应用香菇多糖冲剂治疗反复呼吸道感染患儿60例,临床观察总有效率达96.7%,表明香菇多糖对反复呼吸道感染患儿有广泛的免疫刺激作用。另据资料报道,香菇多糖注射液与抗生素合用,能有效防治反复呼吸道感染的发生。

3.4治疗其他疾病

采用口服香菇多糖加二氧化碳激光治疗尖锐湿疣,比单独用二氧化碳激光治疗的疾病复发率明显降低。口服香菇多糖结合皮肤处外用皮质类固醇制剂治疗银屑病,有效率达92.11%。

4香菇多糖的制备

    香菇多糖多从子实体中提取,也有研究者用香菇下脚料提取多糖,潘继红等以香菇柄为原料,用蒸馏水、0.5%草酸铵溶液两种提取剂提取香菇柄粗多糖,其提取率分别为0.103%,0.164%,表明香菇柄有一定的开发价值。

    香菇子实体生产周期长,产量及多糖提取率均较低。采用深层发酵技术培养香菇菌丝体,不仅发酵液中含有与子实体相同且含量更高的营养成分,且可利用农副产品作原料,成本低,周期短,易于大规模生产,已得到广泛重视及应用。邵伟等采用液体发酵培养的方法获得香菇发酵液(LEL),发酵液经离心收集菌丝体,并从菌丝体中提取胞内粗多糖(LEPI)。刘美琴等将从香菇菌丝体中提取的粗多糖,经DE52柱层析,得到均一的多糖成分,命名为LE。为了提高发酵过程中香菇多糖的产量,滕利荣等_21_通过正交设计法对香菇发酵培养基中氮源最佳配比进行探索,发现香菇多糖的产量在发酵130 h时最大,其浓度可达25.1mg/mL,经分离纯化得到两种组分的香菇多糖。郑典元等L22j采用正交设计法研究了香菇菌丝液体发酵碳源对香菇多糖产量的影响,试验发现,发酵生产香菇多糖的最佳碳源为6%葡萄糖,4%淀粉,2%蔗糖,添加淀粉作碳源有利于香菇菌丝生长发育和多糖的积累。孙永林等E23]在培养基中加入木质纤维素后,香菇胞外多糖含量最多可提升0.99 g/L。

    从子实体和发酵培养的菌丝体中分离的多糖分子结构有一定的差异。目前对香菇多糖研究较多的是一种商品名为Lentinan的β-(1→3)-D-葡聚糖。Shida等L241用3%三氯乙酸和1 mol/L NaOH溶液,从香菇子实体中分别提取出一种杂半乳糖和β-(1→3)-D-葡聚糖。Tomati等将从发酵香菇菌丝体中得到的香菇多糖进行一维及二维NMR分析,确定两种多糖分别为木聚糖及葡聚糖。

5  香菇多糖的提取纯化

    多糖的分离提纯涉及两个方面:(1)将多糖与低分子有机物、无机盐等成分分离,或者与蛋白质、酯类等高分子量的自然产物分离;(2)单一多糖的分离提纯。

5.1香菇多糖的提取

    香菇多糖一般采用不同温度的水或稀碱溶液提取。在其浸提参数中,温度是影响多糖提取的主要因素,另外浸提固液比、浸提时问等也均影响提取率。此外,还有其他的一些提取方法。曾智平等发现微波法的提取率高于传统热水法,并且缩短提取时间和减少能耗。念保义等127J研究了超声波提取香菇多糖,发现将香菇粉末用功率为80 W的热水超声提取13 min,可以防止多糖降解和多糖活性的降低,并且能缩短提取时间,减小料液比,提高提取效率,降低生产成本。张欣等采取复合酶解法结合热水浸提法提取香菇柄多糖,提取率达71.3%,是热水浸提法的3.43倍,酶解的最适条件为pH 4.5、温度46℃、提取时间80 min。Yap和Ng将水提醇沉后的香菇粗多糖在液氮中冻干,冻干物用热水溶解,离心除去不溶物,上清液用等体积的95%乙醇在4℃下沉淀过夜,离心,将沉淀物冻干后得β-D-葡聚糖,其纯度经糖柱分析后可达到87.5%,与传统的方法相比这种方法更加省时、高效、成本低。

5.2香菇多糖的纯化

    常用的纯化方法有:沉淀法、柱层析法、制备性高效液相法、制备性区域电泳法、超滤法等。目前多采用各种不同的凝胶层析柱色谱和离子交换柱色谱。

    凝胶色谱是一种分辨率低、载样量少的分离技术,但方法简单、快速。常用的凝胶有葡聚糖凝胶(Sephadex)和琼脂糖凝胶(sepharose),以不同浓度的盐溶液和缓冲溶液作为洗脱剂,使不同大小的多糖分子得到分离纯化。离子交换色谱是通过载体表面带电基团与样品离子和淋洗离子进行可逆交换、离子偶极作用和离子吸附,来实现色谱分离。不同多糖尤其是多糖与蛋白质结合在一起的复合多糖,在一定pH条件下所带电荷不同,根据各多糖上电荷的差异来达到分离目的。燕航等L30 J将香菇多糖粗制品用DEAE-纤维素柱层析,经NaCl洗脱,得到6个香菇多糖级分A~F;然后用sephadex G-200柱进一步纯化香菇多糖B级分,得到香菇多糖亚级分B-1和B-2。邵伟等E19]采用液体发酵培养的方法获得香菇胞内粗多糖,再经DEAE柱层析和Supdex200凝胶层析到一种蛋白多糖复合物。刘美琴等将香菇粗多糖进行DE52柱层析,得到均一的多糖成分,其平均分子量为5.08×105。阮征等用香菇水提物,经过DEAE-Sephadex A-25和Sephadex G-200凝胶柱色谱得到均一多糖级分L-2A。

    超滤技术是一种膜过滤技术,其原理主要是筛分作用,其中分子大小是其分离的主要依据,但分子形状和电荷也起着重要作用。利用膜的选择性,通过在膜两侧存在的能量差而造成溶液中各组分通过膜的迁移速率的不同,实现非均相物系的分离。利用超滤分离技术,易获得多糖粗品,得糖率高,工艺流程简单,工序少,提取时间短。李志洲[321利用超滤膜分离装置进行香菇多糖的提取分离,建立了香菇多糖提取液超滤过程修正凝胶极化模型,这种工艺的香菇多糖提取率达6.10%,多糖粗品含量在90%以上。郑宗昆等采用螺旋卷式超滤器对香菇多糖进行提取研究,结果在此试验范围内,用微滤作预处理的好于离心法处理,用超滤温度为250C,pH值接近浸提介质的pH值,超滤压力为0.15~O.18 MPa,制得的香菇多糖纯度达74.4%,回收率为79.6%。谢红旗等采用截留分子量为50 kD和300 kD的两种陶瓷膜,将预处理过的香菇料液分成三种不同分子量范围的多糖。

6  展望

    随着分子生物学的发展和香菇多糖研究的不断深入,科学家们已经开始在基因水平探讨香菇多糖生物活性的机制。多糖生物活性与结构问的关系的研究还落后于核酸与蛋白质的研究。目前主要集中在香菇中β-(1→3)-D-葡聚糖的研究上,其他多糖组分与生物活性之间的关系还有待进一步的明确。目前多糖的提取率普遍不高,提高香菇多糖的提取率已成为多糖产品开发需要解决的一个关键问题。不仅可以考虑将多种提取手段结合起来优化提取工艺,还可以通过遗传育种、基因重组、物种诱变等手段选育出高产多糖的香菇菌株,提高香菇的多糖含量,以增加多糖的提取率,降低生产成本。

    今后对lentinan和其他活性类多糖的研究主要着重于3个方面:(1)多糖生物活性的生理机制的探索。虽然研究和发表的文章很多,但其机理还没有完全搞清楚,需要作进一步的探究;(2)多糖构效关系的研究。多糖是一种承载着巨大构相变量的生物大分子,可以传递细胞之间海量的生物信息,要完全阐明这个关系,单凭生物学的手段是远远不够的,只有通过物理、计算机、数学、化学等综合手段的应用,才能获得突破性的进展和成果,这也必将对21世纪生命科学产生巨大的影响;(3)应用研究。通过化学手段对多糖分子进行改性,使其具有更多的生物活性或者强化已有的生物活性,能够更广泛地应用于临床。

吕国英,范雷法,张作法,潘慧娟

(浙汀省农业科学院园艺研究所,浙江杭州310021)

浙江农业学报2009.2

 
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